Fundamentos de la técnica del adn recombinante y su utilización en la ingeniería genética
Contenido
El dogma central de la biología molecular
Todos los seres orgánicos que conocemos comparten varias características. Una de ellas es la naturaleza del material genético y la forma en que se producen las proteínas, un proceso conocido como el «dogma» central de la biología molecular.
Con la excepción de un par de virus, todos los organismos almacenan información genética en el ADN (ácido desoxirribonucleico), recogido de forma muy compacta y organizada en el núcleo de la célula.
Para la expresión de los genes, la molécula de ADN se transcribe en ARN mensajero, y éste se traduce al lenguaje de los aminoácidos, los componentes básicos de las proteínas.
¿Qué es el ADN recombinante?
Entre los años 70 y 80, los biólogos moleculares comenzaron a aprovechar los procesos que ocurren naturalmente dentro de la célula y fueron capaces de extrapolarlos al laboratorio.
De esta manera, un gen de origen animal (un vertebrado, por ejemplo) podía ser insertado en un segmento de ADN de una bacteria; o el ADN de una bacteria podía ser combinado con el ADN viral. Así, podemos definir el ADN recombinante como una molécula compuesta de ADN de dos organismos diferentes.
Una vez creada esta molécula híbrida o recombinante, procedemos a la expresión del gen de interés. La expresión de la palabra se refiere al proceso de traducción a la proteína.
Enzimas de restricción y ligasas: la clave del proceso
Un elemento clave en el desarrollo de la tecnología del ADN recombinante fue el descubrimiento de las enzimas de restricción.
Estas son moléculas de proteína que exhiben la capacidad de dividir el ADN (nucleasas) en secuencias específicas, sirviendo como «tijeras moleculares». Los fragmentos generados por estas enzimas se llaman fragmentos de restricción.
Estas enzimas pueden producir cortes simétricos (en ambas cadenas a la misma altura) o asimétricos en la secuencia objetivo. Un aspecto clave de la acción de las enzimas de restricción es que tras la división de las cadenas se obtiene un «borde suelto», complementario del otro borde cortado por la misma enzima.
Ejemplos de ello son ECOR 1 y Sma 1. En la actualidad se conocen y se comercializan más de 200 tipos de enzimas de restricción.
Para que sean útiles, las tijeras deben ir acompañadas de la cola. Esta acción de sellado del ADN (previamente tratada con las enzimas de restricción) es llevada a cabo por las ligasas.
¿Qué es un «clon»?
Antes de continuar con el protocolo experimental, debemos señalar que en la biología molecular y la biotecnología el término «clon» y el verbo «clon» se utilizan ampliamente. Esto podría llevar a confusión.
En este contexto, no nos referimos a la clonación de un organismo entero (como en el caso de la famosa oveja Dolly, por ejemplo), sino a la clonación de un fragmento de ADN, que puede ser un gen. Es decir, producir muchas copias – genéticamente idénticas – de la secuencia.
Aislamiento y obtención del ADN
El primer paso es decidir qué secuencia quieres usar. Esto depende enteramente del investigador y de los objetivos de su trabajo. Luego, este ADN debe ser aislado y purificado. Los métodos y procedimientos para lograr esto dependen del organismo y del tejido.
Normalmente se toma una porción de tejido y se trata en un tampón de lisis con la proteinasa K (una enzima proteolítica) y luego se extrae el ADN. El material genético se fragmenta entonces en pequeños trozos.
Vector de clonación
Después de los pasos preparatorios, el investigador busca introducir el segmento de ADN de interés en un vector de clonación. A partir de ahora este segmento de ADN se llamará ADN blanco.
Plásmidos
Uno de los vectores más utilizados en un plásmido bacteriano. Un plásmido es una molécula circular de ADN de doble cadena que encontramos naturalmente en las bacterias. Son entidades fuera del cromosoma bacteriano, es decir, son extracromosómicas, y se encuentran naturalmente en estos procariotas.
Los elementos básicos de un vector son: a) una fuente de replicación, que permite la síntesis de ADN; b) un agente de selección, que permite la identificación de los organismos portadores de plásmidos con el ADN objetivo, como la resistencia a algunos antibióticos; y c) un sitio de multiclonación, donde se encuentran las secuencias que serán reconocidas por las enzimas de restricción.
El primer ADN recombinante que tuvo éxito en el laboratorio se clonó en el plásmido pSC101 de la bacteria E. coli. Contiene un sitio de restricción para la enzima de restricción EcoRI y un gen de resistencia a los antibióticos, así como el origen de la replicación.
La inserción del ADN blanco en el plásmido se realiza utilizando las herramientas moleculares de las enzimas de restricción y las ligasas descritas en la sección anterior.
Tipos de vectores restantes
Además de los plásmidos, el ADN puede insertarse en otro vector, como el bacteriófago lambda, los cósmidos, los YAC (cromosomas de levadura artificiales), los BAC (cromosomas bacterianos artificiales) y los fagémicos.
Una vez obtenida la molécula de ADN recombinante (gen de interés en el plásmido u otro vector) se introduce en un organismo huésped, que puede ser una bacteria.
Para introducir ADN extraño en una bacteria se utiliza una técnica llamada transformación bacteriana, en la que el organismo es tratado con cationes divalentes que lo hacen susceptible a la captación de ADN.
Metodológicamente, no podemos garantizar que el 100% de las bacterias de nuestro cultivo hayan tomado efectivamente nuestra molécula de ADN recombinado. Aquí es donde la porción del plásmido que contiene la resistencia a los antibióticos entra en juego.
Así, la bacteria que ha tomado el plásmido será resistente a un cierto antibiótico. Para seleccionarlas, será suficiente aplicar ese antibiótico y tomar los sobrevivientes.
Después de seleccionar la bacteria con nuestro ADN recombinante, procedemos a utilizar la maquinaria enzimática del huésped para generar el producto proteínico de interés. A medida que las bacterias se reproducen, el plásmido pasa a su descendencia, por lo que no se pierde durante la separación.
Este procedimiento utiliza la bacteria como una especie de «fábrica» de proteínas. Más adelante veremos que ha sido un procedimiento muy relevante en el desarrollo de tratamientos médicos efectivos.
Una vez que el cultivo está listo y la bacteria ha producido grandes cantidades de proteína, se produce la lisis o ruptura de la célula. Existe un amplio abanico de técnicas bioquímicas que permiten la purificación de las proteínas según sus características físico-químicas.
En otro contexto experimental, puede que no estemos interesados en generar la proteína, sino en obtener la secuencia de ADN per se. Si así fuera, el plásmido se utilizaría para crear múltiples copias del fragmento que nos interesa con el fin de tener suficiente ADN objetivo para realizar los experimentos pertinentes.